23Abril2014

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Métodos de Reconocimiento, Identificación e Individualización de manchas de semen (1era parte)

Métodos de Reconocimiento, Identificación e Individualización de manchas de semen

Parte I

Por: Iris Catherine Carma

Lcda. En Biología (UCV), Esp. En Criminalística (IUPOLC)

     El estudio de las manchas de semen constituye una prueba precisa y útil en la resolución de casos asociados a delitos que afectan las buenas costumbres y el buen orden de las familias. Existen en el semen una serie de sustancias que ayudan al investigador criminalista a presumir o confirmar la presencia de manchas de éste fluido en el sitio del suceso, victima(s) y/o victimario(s). Entre los métodos de reconocimiento, identificación e individualización del semen tenemos: la ubicación de las manchas con diferentes fuentes de luz, identificación de la muestra mediante la aplicación de los ensayos cristalográficos (Florence y Barberio), la búsqueda de células espermáticas con diferentes métodos de tinción, detección del núcleo del espermatozoide humano por inmunofluorescencia, detección de la enzima fosfatasa ácida prostática por reacción enzimática y detección del antígeno prostático (PSA ó P30) y la proteína semenogelina (SG) mediante inmunocromatografía. En cuanto a la individualización de manchas de semen, en la actualidad están disponibles una serie reactivos para la maceración, conservación y extracción del ADN de la muestra, además una gama muy amplia de kits que permiten la amplificación y posterior secuenciación de fragmentos de su material genético.

 


Introducción

     El estudio de las manchas de semen tiene gran importancia en la criminalística, pues al igual que la sangre, constituye una prueba muy precisa. Debido a su procedencia, su estudio generalmente se encuentra asociado a delitos que afectan las buenas costumbres y el buen orden de las familias, por ejemplo; casos de violación, actos lascivos, acto carnal con menores y el ultraje al pudor, entre otros. En todos los casos, el informe pericial que emite el experto adquiere fundamental importancia para la investigación, esclarecimiento del hecho y calificación legal.

 

¿Qué es el semen?

     El semen[1] o esperma es un líquido viscoso, ligeramente alcalino, blanquecino a amarillento, de olor sui generis, que es expulsado a través del pene en la eyaculación. El semen está constituido por una suspensión de espermatozoides en el plasma seminal[2], y se forma por el aporte de los testículos, el epidídimo, la vesícula seminal, la próstata, las glándulas de Cowper, las glándulas de Litre y los vasos deferentes[3],7.

 

     Los espermatozoides1 son células haploides que constituyen el gameto masculino de los animales, su función es la formación de un cigoto al fusionarse su núcleo con el del gameto femenino (ovulo). La función del plasma seminal[4] es aportar un medio nutritivo con osmolalidad y volumen apropiado para el transporte y sobrevivencia de los espermatozoides en el aparato genital femenino. Menos del 10% del volumen total del semen corresponde a los espermatozoides, el otro 90% al líquido seminal[5].

 

     Durante la eyaculación podemos distinguir varias fracciones del volumen total del semen con diferente composición química:

1)     La Fracción Pre-eyaculatoria (10% al 15% del volumen total): Procede de las secreciones de las glándulas de Cowper y Litré. Este líquido se descarga por la uretra por estímulo erótico, es de consistencia mucosa, transparente y no presenta espermatozoides. Este hecho es de gran relevancia pericial, ya que es posible al examinar una mancha de naturaleza seminal, no hallar espermatozoides3. La función de esta fracción es hacer más resbaladizo el canal de la uretra (lubricante).  

2)     La Fracción Previa o prostática (13% al 33% del volumen total): Proviene de la próstata, es fluida, no presenta espermatozoides. Tiene una elevada concentración de fosfatasa ácida y ácido cítrico. 

3)     La Fracción Principal (5% al 10% del volumen total): Procede del epidídimo y de los conductos deferentes, presenta elementos líquidos y gelatinosos. Es la fracción que contiene la mayor cantidad de espermatozoides.

4)     Fracción Terminal (50% al 60% del volumen total): Procedente de las vesículas seminales. Es de consistencia gelatinosa o coloide y contiene una considerable cantidad de fructosa.

 

     En general, las secreciones de los órganos accesorios protegen el tracto urinario de agresiones de patógenos, interceptándolos o bloqueándolos. El mecanismo de lavado de la uretra por estas secreciones, establece un medio hostil a los patógenos5. El semen también puede contener algunas células desprendidas del epitelio de los conductos excretores y de la uretra.

 

     En caso de infecciones, el semen puede llegar a contener altas concentraciones de virus o gérmenes, por ejemplo, el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), que provoca el SIDA[6] ó el Virus de la hepatitis B (VHB), por lo tanto, el técnico y el analista de laboratorio que trabajan con evidencias de tipo biológico deben extremar las medidas de bioseguridad durante su manipulación. Las normas de bioseguridad indican al manipulador de la evidencia cómo hacer para cometer menos errores y no sufrir accidentes y, si ellos ocurren, cómo minimizar sus consecuencias, estas normas son prácticas, fáciles de entender y aplicar.

     Se recomienda revisar el “Manual de Capacitación de Analistas de ADN y el de Capacitación de Laboratorios Forenses”, de la Iniciativa “President´s DNA[7], la guía de “Recomendaciones para la recogida y envió de muestras con fines de identificación genética”, del grupo Español y Portugués de la ISFG[8], y la “Guía de Capacitación y Directrices-Evidencias Biológicas”, del Grupo de Trabajo Científico en Técnicas y Análisis de ADN (SWGDAM)[9], para adquirir información sobre los protocolos, directrices, seguridad y riesgo en el manejo de evidencias biológicas y reactivos químicos que se utilizan en un laboratorio de tipo biológico y de biotecnología.

 

Ubicación de las Manchas de Semen:

     Las primeras pruebas utilizadas en el análisis de manchas de semen fueron organolépticas y algunas reacciones químicas, sin embargo, estas pruebas daban resultados similares en sustancias como el moco y la grasa cruda de origen animal, cuyas apariencias sobre tela son similares a la del semen[10].

 

     En 1826, Olliver d’Angers y Barruel[11] informaron sobre un caso de agresión sexual donde se sospechaba que ciertas manchas en la ropa de la victima fueron hechas intencionalmente con grasa de origen animal. Los expertos analizaron las ropas con respecto a su solubilidad en agua, naturaleza, color y conducta en alcohol absoluto. Ambos concluyeron que la mancha era de semen. En aquella época los investigadores se guiaban solo por estos parámetros.

 

     Hoy día es bien sabido que las manchas de semen presentan algunas características en razón al soporte donde se asientan5. Sobre tejido absorbente (sábanas, ropas, etc.), exhiben un color blanco-amarillento, la forma de sus bordes es irregular, similar a los mapas topográficos. (Ver Figura 1). Estas manchas producen efecto de “apergaminamiento” y “almidonamiento” del soporte5. Sobre superficies no absorbentes rugosas (cerámica), el semen formará costras o escamas más o menos grandes de color blanquecino transparente. Sobre superficies lisas (pisos pulidos) el semen se extiende formando una mancha grande, delgada y casi transparente, poco visible en superficies oscuras.

Fig. 1.- Mancha de semen sobre gasa (soporte absorbente poroso). Fotografía Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

 

 

Fuentes de Luz:

 

     La finalidad de utilizar una fuente de luz, es la búsqueda, cuando no puede precisarse el lugar donde se cometió el hecho o cuando el soporte mimetiza la mancha.

 

Lámpara de Wood ó Luz Negra:

     En 1919 el Dr. Wood publicó un artículo en Francia y señaló la posible utilización de la lámpara de Luz ultra violeta (UV) para el análisis de fluidos del cuerpo. Con el tiempo, esta fuente luz ha tomado la denominación de "lámpara de Wood", ó Luz negra.    Bajo la acción de las radiaciones UV  las manchas de semen presentan una fluorescencia blanco-amarillenta, aumentando la intensidad del tono amarillo con el paso del tiempo (ver figura 3).

 

Fig. 2.- Lámpara de Wood

 

Fig.3.- Mancha de semen bajo luz UV, irradiada en un cuarto oscuro. Fotografía Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

     La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de tipo UV, rayos catódicos o rayos X. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano), son transformadas en luz visible. La luz puede ser apreciada mientras la superficie es irradiada con la fuente de luz. El espectro de excitación de las muestras de semen tiene longitudes de onda que van de 350 nm (Luz UV) a 500 nm (Luz Azul-verde)[12].

 

     A. R. Calloway aconseja examinar las manchas sospechosas de ser semen por su  fluorescencia y fosforescencia3,5. La Fosforescencia es el fenómeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energía y almacenarla, para emitirla posteriormente en forma de luz. El mecanismo físico que rige este comportamiento es el mismo de la fluorescencia, no obstante la principal diferencia con ésta, es que hay un retraso temporal entre la absorción y la re-emisión de los fotones de energía.

 

     Calloway recomienda la siguiente secuencia de observación con luz UV5:

1.     Examen directo con luz UV (l 365 nm) a temperatura ambiente: en general se observan las manchas de semen por la fluorescencia característica, excepto cuando el tejido presenta tratamiento de blanqueado óptico.

 

2.     Examen directo con luz UV (l 365 nm) previa refrigeración, ó el material puede ser colocado sobre hielo seco, cuya temperatura de volatilización es de -78,5 ºC: La fosforescencia de las manchas persiste 20 segundos después de retirada la fuente de luz UV.

 

     Otros fluidos del cuerpo producen fosforescencia a baja temperatura, por lo que la técnica de Calloway es de orientación y no de certeza. Calloway y cols. han detectado fosforescencia en manchas de sudor, no así en saliva ni sangre[13]. La fluorescencia y fosforescencia del semen está relacionada con la presencia de los aminoácidos tirosina y triptófano, una base nitrogenada llamada flavina y algunas veces por la presencia de la bacteria Pseudomona fluorenscens. El semen también contiene pequeñas cantidades de una molécula fluorescente llamada colina5.

 

Lámpara de Bretton ó Luz Azul:

     La Lámpara Bretton, luz azul, o luz forense, tiene un principio y uso similar a la lámpara de Wood, pero toma en cuenta la fluorescencia de fondo, por lo que el observador debe usar gafas con un filtro especial para eliminar la luz de fondo y dejar pasar la luz fluorescente proveniente sólo de la mancha de semen[14]. La capacidad de bloqueo de los filtros es directamente proporcional a la sensibilidad del sistema para detectar cantidades muy pequeñas de semen.

 

Fig. 4.- Lámpara de Bretton o luz Azul17.

 

     En la técnica de Bretton[15] hay dos sistemas ópticos a considerar; la fuente de excitación (Luz Azul) y el filtro barrera de luz (Lentes Naranja) (Ver figura 4). La mancha de semen al ser irradiada con la fuente de luz azul absorberá parte de la misma y emitirá en el espectro de luz amarillo-naranja-rojo, y con la ayuda del filtro (lentes naranja), se observaran las manchas fluorescentes color naranja. Hay que tomar en cuenta la fluorescencia de algunas cremas o aceites, así como la de algunos colores claros y/o satinados.

Fig.5.- Mancha de semen visualizada con filtro naranja, irradiada con luz azul. Fotografía Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

 

 

Poliligth® PL500sc:

     Poliligth® PL500sc es una fuente de luz portátil de alta intensidad, que produce diferentes longitudes de ondas graduales, que oscilan entre 310 y 650 nm.  Tiene aplicación en la detección de huellas dactilares latentes, saliva, sangre y semen[16]. En este sistema también se utilizan sistemas de filtro para la visualización de las manchas y su principio es el mismo que el de la lámpara de Bretton18, descrito con anterioridad.

 

Fig. 6.- Mancha de semen sobre algodón blanco y rosado, visualizada con la lámpara Poliligth®PL500 a 450 nm de excitación, utilizando como filtro lentes color naranja.

Fig. 7.- Mancha de semen sobre algodón visualizada con la lámpara Poliligth®PL500sc a 450 nm de excitación, utilizando como filtro lentes color naranja18.

 

Ensayos cristalográficos:

      El primer artículo sobre estos ensayos apareció en 1896, y estas  pruebas se siguen utilizando hoy día en algunos laboratorios, consisten en la aplicación de reactivos que inducen la formación de cristales que pueden luego ser observados bajo el microscopio.

 

Ensayos de Florence y Barberio:

     En 1895 y 1896, el Dr. Florence[17] en Lyon publicó una serie de documentos refiriendo sus estudios en fluidos seminales y su aplicación médico-legal. Para esta época, el ahora familiar test de Florence fue introducido y considerado como presuntivo, el cual puede ser practicado antes de iniciar una búsqueda cuidadosa de células espermáticas u otro elemento en manchas sospechosas de semen. Este ensayo se basa en la formación de cristales de yoduro de colina (ver figura 8) a partir Iodo y la colina presente en el semen.

 

     La colina es una base orgánica presente en todas las células que interviene en el transporte de lípidos y en su metabolismo al formar los fosfolípidos. La Colina proveniente de la vesícula seminal  se origina a partir de la escisión del grupo fosfato de la fosforil-colina por la acción de la enzima fosfatasa.

 

 Colina

     Hektoen y McNally[18] en 1923, consideraron que un test de Florence positivo podía entrañar una posibilidad, pero un test negativo indicaba la ausencia de semen inequívocamente. Sin  embargo, se conoce que la positividad de la reacción depende de la presencia de colina libre en el fluido seminal. Kind S. realizó algunos experimentos donde no observaba resultados con este test, notando que al disolver la muestra en agua destilada e incubar a 37º C por 30 min. obtenía resultados positivos, este comportamiento se debe a que en la mancha seca se detiene la actividad hidrolítica de la fosfatasa, por lo tanto, no se puede tener la colina en su forma libre, sino como fosforil colina.

 

     Kahane[19] y colaboradores en 1937, llevaron a efecto un número de estudios sobre la bioquímica, metabolismo y distribución tisular de colina, ambos científicos señalan que el semen humano contiene entre 11.2 y 14.4 mg de colina/100 ml de semen, también señalan que cualquier tejido o material biológico, como p. e., la sangre, con altas concentraciones de colina, daría positivo en el test.

 

     Los cristales característicos de Florence no se forman a partir de moco nasal o vaginal, orina, sudor, saliva, lágrimas, leche materna, ni algunas muestras de semen de animales5.

 

Fig. 8.- Cristales de yoduro de Colina. Fotografía Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

Peryoduro de Colina

 

     En esta reacción el Iodo se une a la colina formándose un cristal en forma de aguja de reloj, color ámbar, denominado yoduro de colina.  (ver figura 8).

 

     En 1905, Barberio[20] publicó un test cristalográfico para fluido seminal, el test de Barberio, que empleaba una solución saturada de ácido pícrico[21]. Se dice que esta reacción es muy sensible, y podían obtenerse resultados positivos con semen, manchas seminales y material seminal parcialmente descompuesto. El moco vaginal, moco nasal y saliva no dan positivo para la reacción. Barberio pensó que la sustancia en el semen responsable para la reacción era orgánica y diferente de la sustancia reactiva en el test de Florence, esta sustancia se hallaba presente en plasma seminal e incluso en muestras de azoospérmicos, Bokarius[22] en 1907 uso ácido pícrico disuelto en ácido acético glacial. En 1913 Baecchi[23] sugirió que los cristales vistos por Barberio podían ser de picrato de espermina. Rosenhein[24] en 1924 mencionó también, que los cristales de Barberio eran de picrato de espermina.

 

     El semen contiene una elevada proporción de sustancias fosforadas, entre las que se encuentran el di-fosfato de espermina. La espermina se produce en la próstata y los testículos. Esta base se ha encontrado también en otros órganos ajenos al aparato genital masculino, desconociéndose su significancia biológica. Conjuntamente también existe en el semen otra base, la espermidina, que puede considerarse el producto de la hidrólisis parcial de la espermina, el olor sui generis del semen se debe principalmente a esta base.

H2N=(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3=NH2

ESPERMINA

 

     En esta reacción el ácido pícrico se une al fosfato de espermina presente en el semen, formándose un cristal fusiforme, amarillo y con forma de arroz, denominado picrato de espermina (Ver figura 9).

 

Fig. 9.- Cristales de picrato de Espermina. Fotografía Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

 

Tinción de células espermáticas:

     Los espermatozoides fueron vistos por primera vez en 1677 por el holandés, estudiante de medicina Johan Hamm[25], que los denominó “animaculae”. Hamm relató esta observación a Antonie van Leeuwenhoek[26] (1632-1723), que un par de años más tarde realizó la primera descripción de los espermatozoides humanos, considerándolos como un componente normal del semen de cualquier animal.

 

     Los espermatozoides son las células reproductoras masculinas[27], cada uno consiste de un núcleo, una pieza media y una cola (Ver figura 10). En los seres humanos, el núcleo tiene aproximadamente 4,5 micras de largo y 2,5 micras de ancho, en él, se conserva el ADN enrolladlo en unas estructuras llamadas protaminas. La cola tiene aproximadamente 40 micras de largo y su función es hacer que el espermatozoide se desplace.   

 

     Un tipo muy singular de núcleo celular, es el de los espermatozoides de los mamíferos. En ellos el ADN no se une a las histonas, sino a otras proteínas llamadas protaminas. Las protaminas son más pequeñas que las histonas y más básicas, con lo que la atracción entre ellas y el ADN es más fuerte y el empaquetamiento mayor, esto favorece la movilidad del espermatozoide. Esta unión del ADN a las protaminas se llama estructura cristalina (ver figura 10). Las protaminas inducen arreglos lineales ondulantes lado a lado y no enrollamiento como las histonas[28]. 

 

Fig. 10: Estructura del espermatozoide

 

     Los espermatozoides de muchas especies de mamíferos son similares en tamaño y forma. Los perros tienen espermatozoides muy parecidos a los del humano, pero tienen aproximadamente un tercio de su tamaño (ver figura 11).    

Fig. 11: Diferencias en los núcleos de los espermatozoides de diferentes mamíferos.

     La visualización de un espermatozoide en una mancha, es prueba de que la misma está constituida, total o parcialmente por semen. Tal reconocimiento es fácil en manchas de semen de reciente data, pero se complica al transcurrir el tiempo29.

 

     Si los espermatozoides han perdido la cola, puede ser difícil reconocerlos con la ayuda del microscopio, sobretodo en muestras contaminadas con bacterias y/u hongos. Si el sujeto donante es aspermico o azospermico, la identificación de la mancha se complica aún más.

 

     Pollack en 1948 estableció una distinción entre "aspermia" y "azoospermia". La primera condición se caracteriza por una ausencia total de espermatozoides en la eyaculación. La eyaculación de una persona que sufre de aspermia, según Pollack, no se debe llamar semen. El término "azoospérmico" se refiere a cualquier muestra seminal en el que los espermatozoides maduros no están presentes.

 

     En la vasectomía se rompen ó ligan los conductos que transportan el semen hasta el pene, así, los hombres vasectomizados no tendrán en el fluido seminal espermatozoides, sólo los componentes del plasma seminal[29].

 

     En la tinción de células espermáticas ocurren una combinación de fenómenos físicos y químicos: la absorción, capilaridad y ósmosis participan en cierto grado. El fundamento de la prueba se basa en la afinidad de los colorantes básicos por los elementos celulares ácidos y de los colorantes ácidos por elementos celulares básicos.

 

     La tinción más conocida en los laboratorios de criminalística a nivel mundial es la denominada “árbol de Navidad7”. Usando el microscopio compuesto, los científicos buscan células espermáticas en láminas portaobjetos preparadas a partir de macerados de hisopos, ropa, etc. Las láminas se colorean con la tinción de Kernechtrot-Picro-indigo-carmin, o "árbol de navidad", donde los núcleos de los espermatozoides se colorean de rojo carmín brillante y las colas de color verde-azulado (ver figura 12). Para obtener el protocolo consulte la siguiente bibliografía: “Laboratory Training Manual, President´s DNA Initiative”, Protocolo 2.04, para la Identificación de células espermáticas.

 

 

Fig. 12.- Tinción Árbol de Navidad (Christmas tree) (rojo rápido nuclear y ácido pícrico-índigo (PIC).

 

     La tinción de árbol de Navidad provee excelentes detalles morfológicos y una buena discriminación entre los espermatozoides y las células epiteliales. Esto es importante en muestras contaminadas o mezcladas.

 

     La tinción histológica tradicional de hematoxilina y eosina (H & E) también es ampliamente utilizada en los laboratorios de criminalística, así como la tinción Giemsa, Diff Quick y Ziehl Neelsen Loefler.

 

 

Fig. 13.- Tinción Diff Quick: Esta tinción fue diseñada para teñir el citoplasma de la célula color rosa y el núcleo de azul. Fotografía Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

 

Testsimplets ®:

     El test consiste en un portaobjetos dotado de una capa de colorantes liofilizados que al ponerse en contacto con la muestra húmeda tiñen las células presentes en ella (Ver figura 14b). Esta capa liofilizada consta de dos colorantes: acetato de violeta de cresilo y nuevo azul de metileno. La afinidad específica de las estructuras celulares por los colorantes ocasiona tinciones que permiten proceder a una clasificación de las células (Ver figura 14a). La intensidad del color y la proporción de mezclado de los colorantes en el recubrimiento del portaobjetos son constantes y están estandarizados, con lo cual se obtienen tinciones fiables. 

 

a)

b) c)

Fig. 14.- Tinción con láminas Testsimplets ®, a) Células espermáticas teñidas, b) Láminas testsimplest, c) Microscopio. Fotografías Tomadas por la  Lcda. Iris Catherine Carma.

 

Detección del núcleo del espermatozoide humano por inmunofluorescencia (Ensayo Sperm Hy Liter):

     El kit SPERM HY-LITER™ contiene un pool de 448 anticuerpos monoclonales extraídos del ratón y derivados del semen humano que realizan el marcaje del núcleo del espermatozoide, este complejo antígeno-anticuerpo es detectado luego con la ayuda de un microscopio de fluorescencia[30].

 

     El ensayo de SPERM HY-LITER™ es sensible, fiable y fácil de usar. La prueba puede detectar un solo núcleo de espermatozoide humano entre una mezcla de células y semen de otras especies. Este ensayo es de certeza para semen humano. Para obtener el protocolo consulte la siguiente bibliografía: “SPERM HY-LITER™ Staining Protocol, de la empresa Independent Forensics, disponible en: http://www.ifi-test.com/pdf/shl_protocol.pdf. Este ensayo puede ser acoplado a los actuales procedimientos para el análisis de ADN.

 

Fig. 15.- Kit Sperm Hy LiterTM

Fig. 16.- Mezcla de células epiteliales y espermáticas observadas con la fase de contraste del microscopio de fluorescencia, luego con el filtro FITC, donde se observa el núcleo de los espermatozoides humanos y con el filtro DAPI donde se observan todos los núcleos de todas las células.

 

     Las laminas portaobjetos preparadas con el ensayo Sperm Hy LiterTM pueden ser visualizadas en cualquier microscopio de fluorescencia equipado con la fuente de luz apropiada y filtros de emisión DAPI y FITC.

 

     Además, de los anticuerpos específicos para espermatozoides humanos, el Kit Sperm Hy Liter incorpora un segundo tinte fluorescente (fluoresceína), que tiñe todos los núcleos de las células presentes en la muestra. La Visualización de los núcleos fluorescentes no es necesaria para la detección de espermatozoides, pero se recomienda en la búsqueda de semen (ver figura 16).

 

Detección de la enzima Fosfatasa Ácida Prostática:

     La fosfatasa ácida protática (PA) es una enzima secretada por la próstata, que está presente en grandes cantidades en el líquido seminal, pero también se puede encontrar en otros líquidos biológicos, incluyendo la sangre y las secreciones vaginales[31].

 

     La prueba de la fosfatasa ácida es una de las más conocidas y utilizadas para la identificación del semen, aparte de la tinción de células espermáticas, se basa en la presencia en el semen humano de niveles altos de fosfatasa, y/o la inhibición de la misma con el ácido tartárico. Esta fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2) es de origen prostático, y a veces se abrevia "AP".

 

     En 1935, Kutscher y Wohlbergs[32] informaron que la eyaculación masculina contiene una enzima que hidroliza diferentes esteres de fosfato a un pH ácido. Su origen se estableció como de la glándula prostática y la enzima que se llamó "fosfatasa de la próstata". El origen prostático de la enzima fue confirmada por Gomori en 1941[33], con el empleo de técnicas de tinción histoquímicas. En 1936, Gutman y sus colaboradores encuentran que la actividad de la fosfatasa ácida es bastante elevada en tejido esquelético metastatico y en pacientes que sufren cáncer de próstata.

 

     En 1945, Lundquist, sugiere que las grandes cantidades de fosfatasa ácida prostática en el semen humano se utilicen como base para la identificación de semen en situaciones médico legales. Los estudios sobre esta posibilidad fueron llevados a cabo en Dinamarca por Hansen (1946), Riisfeldt (1946) y Rasmussen (1945). Rasmussen llevó a cabo ensayos cuantitativos de AP en semen, saliva, orina y secreciones vaginales. Los valores más bajos observados en material seminal superaron en casi 200 veces los valores más altos vistos en los otros materiales.

 

    Sivaram y Bami, en 1971 lograron diferenciar la fosfatasa ácida prostática de las demás fosfatasas, ellos tenían conocimiento de que Fishman y Lerner en 1953 demostraron que la PA prostática es inhibida por el ácido L (+) tartárico, el método Sivaram-Bami se basa en dos hechos; la alta actividad de fosfatasa en el semen humano independiente de los espermatozoides y que la fosfatasa ácida prostática es inhibida por el ácido L- (+) tartárico.

 

     Muchos compuestos fosfatados tales como el fenilfosfato, a-gliserolfosfato, p-nitrofenilfosfato y timolftaleinafosfato han sido usados como sustratos en la medición de la fosfatasa ácida. Muchos de éstos han sido encontrados con falta de sensibilidad o son muy sensibles a la fracción no prostática. En 1971, Roy[34] y sus colaboradores propusieron un método usando sodio-timolftalein-monofosfato como sustrato. Este método fue modificado más tarde por Ewen y Spitzer[35] mostrando un alto grado de selectividad para la fracción prostática y se convirtió en un excelente método manual para las determinaciones prostáticas de fosfatasa ácida, sin embargo, fue limitado en el hecho de que no pudo ser fácilmente adaptado a la instrumentación automatizada. En 1959, Babson[36]  había propuesto un método usando a-naftil-fosfato como sustrato, pero encontró no ser específico para la fracción prostática. Más tarde, en 1971, Hillman[37] modoficó el método Babson incluyendo una sal diazotizada [2- amino- 5- clorotolueno] (Rojo Rápido TR), para formar una tintura diazo que pudiera absorber fuertemente a 405 mm. El L-tartrato fue utilizado como un inhibidor específico de la fosfatasa ácida prostática para establecer una manera de diferenciar la isoenzima prostática de la no prostática[38].

Principio del test:

     La fosfatasa ácida hidroliza el a-naftil-fosfato a a-naftol y fosfato inorgánico. El a-naftol producido es instantáneamente copulado con el Rojo Rápido TR para formar un complejo coloreado (ver figura 17), el cual puede ser medido a 405 mm. El nivel de hidrólisis es proporcional a la actividad presente de la enzima. El L-tartrato se usa para inhibir la fracción prostática sin interferir con la secuencia de la reacción. Por esa razón, el ensayo se realiza con y sin la presencia de L-tartrato, para que la diferencia entre los dos ensayos demuestre el nivel de fosfatasa ácida prostática presente en la muestra.

 

Fig. 17: &-naftol fosfato uniéndose al Rojo Rápido

 

Detección del Antígeno Prostático (PSA ó P30) y la Semelogenina (SG):

     El antígeno prostático (PSA ó P30) es una proteasa producida por la próstata, y se puede hallar en el fluido seminal, fluido prostático, sangre masculina y orina masculina[39]. Se ha detectado una baja concentración de PSA en la leche materna y algunos tumores de mama. Aunque la PSA se encuentra en estos fluidos, es utilizada como indicador de la presencia de semen en muestras de casos penales.

 

     La Semenogelina (SG) es una proteína que proviene de la vesícula seminal, un sustrato para el antígeno prostático específico (PSA) y un marcador útil para la identificación de semen. La SG I y SG II son dos de las principales proteínas secretadas por la vesícula seminal al semen humano. Ellas interactúan, o no, covalentemente a través de puentes disulfuro de forma instantánea formando un coágulo en la eyaculación. El coágulo es licuado después de unos minutos debido a la acción de una proteasa sérica prostática, la PSA, que rompe a la SG en fragmentos. La SG I y la SG II se han encontrado en varios tejidos: las vesículas seminales, el conducto deferente, la próstata, el epidídimo, el músculo esquelético, el riñón, el colon, la tráquea y en tumores en el pulmón[40].

Principio del test:

 

 

   Las muestras maceradas en buffer TB son colocadas en la ventana del dispositivo y van migrando en el papel de filtro interno por capilaridad, en el recorrido, la muestra que contiene el antígeno se encuentra con los anticuerpos, estos forman un complejo Antigeno-anticuerpo-cromófaro, que quedará atrapado en el primer frente, donde está anclado el anticuerpo, desarrollándose una banda color rojo.

 

    En un estudio realizado por Pang & Cheung en el año 2006[41] se evaluaron los tests RSID-Semen (de la empresa “Independent Forensic”) y ABAcard P30 (de la empresa “Abacus Diagnostics”). La prueba RSID-Semen utiliza anticuerpos monoclonales anti-humanos de SG, mientras que la prueba ABAcard P30 utiliza anticuerpos monoclonales anti-humanos de PSA. (ver figura 18).

 

Fig. 18.- Resultados positivos y negativos obtenidos a partir del Test RSID-Semen y el Test ABAcard p30. 20 mL de la muestra se mezclan con 80 ml de Buffer TB, luego se aplica la cantidad de 20 ml a la ventana del dispositivo del test RSID-Semen y del test ABAcard p30. Un resultado positivo se pone de manifiesto por la presencia de dos líneas, una en la región prueba y otra en la región control. Un resultado negativo se indica con una sola  línea en la zona control.

 

     El fabricante de RSID-semen afirma que puede ser detectado 1 ml de fluido seminal humano con su test, mientras que el fabricante del test ABAcard p30 afirma que se pueden detectar hasta 4 ng/ml de PSA con su dispositivo de prueba.

 

     En un ensayo practicado por Ying A., Yang H. Yu, E.F. Diamandis y D.J.A. Sutherland en 199437, ellos reportan que la sensibilidad de la prueba para ABAcard p30 es un poco mejor en este estudio que el anunciado por el fabricante y es comparable a la sensibilidad de otros dos kits comerciales, el PSA Seratec y PSAcheck-Semiquant. La sensibilidad de la prueba de RSID-semen es equivalente a la de otro Kit de detección de SG recientemente comercializado llamado Nanotrap SG. Con ambas pruebas capaces de detectar semen humano y fluido seminal en la norma de 1/50.000, se considera que ofrecen pruebas muy sensibles para la detección de semen.

 

     Muestras de orina de hombres y mujeres fueron probadas con ambos dispositivos. Todas las muestras de orina masculina y ninguna de las femeninas fueron positivos para la PSA. La detección de PSA en orina de varones se esperaba, porque pequeñas cantidades de líquido de la próstata pueden estar presentes en la orina masculina. Ninguna de las muestras fue positiva para el test de la SG.

 

     Otros fluidos corporales, incluidos sangre, saliva, sudor y muestras de heces de tres hombres y tres mujeres, así como leche materna, lubricantes y secreciones vaginales, también se analizaron con los dos dispositivos de prueba, dando resultados negativos y que los mismos no interfieren con el ensayo.

 



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